Что такое ПЦР-анализ: в чем заключается и для чего нужен ПЦР-тест?

Современные лабораторные исследования уже не мыслимы без ПЦР: полимеразная цепная реакция давно стала обыденной и даже рутинной работой, а почти сорок лет назад произвела настоящий фурор в науке, осуществив революцию в генных исследованиях.

Что же такого уникального в ПЦР и какое нынче применение нашел данный метод? СТАРЛАБ рассказывает просто о сложном.

 

ПЦР амплификация: под копирку шагом марш!

Для большинства людей, не связанных с лабораторной диагностикой, слово «ПЦР» появилось на слуху «благодаря» пандемии коронавируса Covid-19 (ПЦР-тест на коронавирус), поскольку ПЦР-тест способен выявить возбудителей данного заболевания и рекламируется всеми медучреждениями. В чем же суть метода и как он работает? Давайте рассмотрим на примере обнаружения вируса — возбудителя Covid-19.

В основе метода ПЦР (Полимеразной цепной реакции) лежит избирательное и многократное копирование (т.е. амплификация) строго определенного фрагмента ДНК. Процесс проводится в пробирке в лабораторных условиях (in vitro). ДНК для эксперимента выделяют из биологического материала, который традиционно именуют «пробой». В роли пробы могут выступать непосредственно кровь, моча, волосы, кусочки кожи, а также различные выделения из организма человека. В общем — все, что содержит клетки с молекулами ДНК. Конкретно для ковид-тестирования берутся пробы (мазки) из носа и полости рта.

ПЦР позволяет определить уникальную последовательность элементов в ДНК и в зависимости от цели исследования дать ответ на различные вопросы. В случае с ковидом — болен ли человек, то есть присутствуют ли в его неповторимой и оригинальной ДНК молекуле фрагменты вируса.

Возбудитель Covid-19 — коронавирус SARS-CoV-2 — не содержит полноценной ДНК, а имеет только РНК, поэтому чтобы выжить в человеческом организме, ему надо проникнуть в клетку и далее уже сделать ее «фабрикой», перепрограммировав на воспроизведение копий самого себя. Поэтому, чтобы обнаружить вирус в биоматериале, надо вначале преобразовать РНК в ДНК, поскольку амплифицировать можно исключительно ДНК. Этот процесс называется «обратной транскрипцией».

С помощью химрастворов пробу очищают от белков и жиров, оставляя только чистую РНК, которая, если человек болен Covid-19, содержит не только собственный генетический материал человека, но и РНК вируса. Эту очищенную пробу транскрибируют в ДНК, после чего начинается собственно ПЦР.

Следует отметить, что такие дополнительные сложности сопутствуют в основном обнаружению вирусов. Для других целей ПЦР (различные криминалистические исследования, установление отцовства и т.д.), обратная транскрипция не нужна и можно сразу приступать к проведению полимеразной реакции.

 

Как происходит ПЦР-тест

Особенность ПЦР, делающая метод выгодным и удобным, состоит в том, что в ходе исследования копируются короткие фрагменты ДНК: их средняя длина — не более трех тысяч пар оснований. Для сравнения полная длина генома человека состоит из 3 миллиардов пар оснований!

Процесс полимеразной цепной реакции весьма интересный.

В пробирку, объем которой обычно варьируется от 0,1 до 0,5 мл кладут 0,1–0,01 мкг уже готовой выделенной геномной ДНК или, если таковой нет — непосредственно биоматериал — мочу, кровь, сперму, соскобы кожи, слюну, волосы. Образование нуклеотидной цепи, на которой и построен метод ПЦР, осуществляется специальным ферментом — ДНК-полимеразой (отсюда и название реакции — полимеразная!), но для старта ферменту необходим «толчок». Дают его, фактически запуская стартовый механизм реакции, вещества-«затравки», называемые праймерами. Для ПЦР в роли праймеров выступают синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. По технологии затравок должно быть две, и они обязательно должны совпадать с участками ДНК-матрицы по краям, чтобы прилипнуть к ним и служить маркерами-ограничителями для участка, который будет многократно копироваться основной «рабочей лошадкой» реакции — ДНК-полимеразой. Концы праймеров, которые в ходе реакции прилипнут к концам фрагмента ДНК, направлены внутрь него, поэтому визуально затравки можно сравнить с колпачками-ограничителями. Ориентируясь на эти «колпачки» на концах фрагмента, ДНК-полимераза «понимает» с каким ограниченным участком ей надо работать.

Чтобы праймеры смогли присоединиться к исследуемому фрагменту ДНК (матрице) и обрамить его, пробирку со смесью вначале нагревают до 95°С в течение 1-2 минут. Этого времени и температуры достаточно, чтобы молекула ДНК, имеющая спиральный вид, изменила свою конструкцию в ходе процесса денатурации биополимеров (денатурация — изменение структуры молекулы, приводящее к потере ее естественных свойств). В случае с молекулой ДНК ее спирально закрученные нити расходятся, разделяются и выравниваются в две полосы. После этого начинается вторая стадия реакции, заключающаяся в охлаждении пробирки до температуры, позволяющей праймерам найти в геномной ДНК комплиментарные места, с которыми они совпадают, и прилипнуть к ним. Для различных праймеров температура второй стадии будет разная, но как правило, она колеблется в районе 60°С. Когда процесс прилипания праймеров к фрагменту ДНК завершен и участок уже отмечен ими, наступает завершающий этап реакции, на котором в дело вступает ДНК-полимераза.

Чтобы ДНК-полимераза начала работать, в пробирке устанавливают температуру 37°С. Стартует синтез новой цепи ДНК. ДНК-полимераза ползет по обрамленному праймерами участку ДНК-матрицы и воспроизводит из самой себя, как из строительного материала, точную копию отплавившиеся в ходе денатурации нити геномной ДНК. Поскольку молекула ДНК двуцепочечная, то изначально матриц две. Следовательно, из одной изначальной молекулы получается две копии гена. Процесс копирования повторяется, и каждый раз стартовое на момент начала реакции количество гена ДНК будет увеличиваться вдвое. За 25-35 циклов в пробирке синтезируются миллиарды копий фрагмента ДНК, обрамленного праймерами. Такого количества генного материала достаточно для любых дальнейших исследований.

 

ПЦР вокруг нас

Полимеразная цепная реакция за почти сорок лет существования и улучшения нашла широкое применение в науке, криминалистике, медицине, биологии. ПЦР используют везде, где необходима высокая точность результатов и играет роль быстрота процесса диагностики.

Вот лишь несколько примеров, для каких целей используют ПЦР-тест в современных лабораториях:

1. В судебно-медицинской экспертизе метод ПЦР помогает устанавливать обстоятельства преступлений путем анализа биологического материала и раскрывать сложные и запутанные дела.
2. С помощью ПЦР можно установить родство людей, а также отцовство и материнство.
3. В венерологии и инфекционной медицине полимеразная цепная реакция помогает выявить хламидийные и микроплазменные инфекций, герпес, сифилис, туберкулез, гепатит, ВИЧ и другие заболевания.
4. ПЦР-исследование штаммов гриппа в конкретно взятом ареале распространения позволяет разрабатывать вакцины против локальных штаммов.
5. В летний период ПЦР-тест помогает диагностировать заболевания, передаваемые клещами: боррелиоз (болезнь Лайма), энцефалит.
6. В генной инженерии ПЦР применяют для клонирования генов, чтобы создать белки, используемые в сельском хозяйстве, селекции и других сферах деятельности.

Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. Сделать тест ПЦР можно только в лабораторных условиях.

 

Гениальный изобретатель гениального изобретения

Появлением метода ПЦР современная цивилизация обязана американскому биохимику Керри Мюллису (Kary Mullis), который в 1983 году по дороге с работы домой придумал, как можно на основе относительно короткого фрагмента ДНК идентифицировать живые организмы.

В основе новаторской идеи Мюллиса лежала идея американского ученого Артура Корнберга (Arthur Kornberg), не нашедшая признания в биохимии того времени. Керри Мюллис, фактически совершивший своим открытием революцию в науке, стал лауреатом Нобелевской премии лишь в 1993 году: путь ученого к признанию был тернистым, ему не раз приходилось отстаивать свои авторские права на метод ПЦР.

Современники и коллеги Мюллиса отмечают, что биохимик всегда был очень неординарной и яркой личностью, с трудом вписывающейся в академическую научную среду. Вот несколько примеров из жизни Мюллиса, которые раскрывают его удивительный характер:

• В детстве ученый интересовался полетами и космосом, разрабатывал, собирал и запускал в небо самодельные ракеты, которые могли набирать высоту до нескольких километров. Одна такая ракета с лягушкой на борту даже напугала пилотов пассажирского самолета. Интерес к химии у Мюллиса начался с экспериментов с взрывчатыми веществами, которые также регулярно пугали соседей.
• Многие ученые считают Мюллиса эксцентриком, так как он длительное время публично выступал за легализацию легких наркотиков и утверждал, что американцы не были на Луне, а всемирно известные кадры высадки сняли в павильонах Голливуда.
• Будучи по специальности биохимиком и всю жизнь работая в этой сфере, Керри Мюллис мечтал о карьере писателя, публициста и поэта. Долгие годы он «писал в стол» стихи и прозу, а также небольшие публицистические обзоры. Мюллис отзывался о своем литературном таланте с иронией, однако его нобелевская речь, живая, яркая и динамичная, имеет художественную ценность и до сих пор является одной из лучших за всю историю премии.
• Судьба метода ПЦР-амплификации, тоже не была простой. Как рассказал сам ученый, первую ее версию Редакции самых престижных научных журналов Science и Nature отклонили статью Мюллиса про ПЦР-метод, заявив, что публикуют только статьи, имеющие общенаучное значение, ПЦР-амплификация может быть интересно лишь узким специалистам.
• В 1990 году Мюллис все-таки получил признание и был награжден престижной немецкой премией Preis Biochemishe Analytik, два года спустя его назвали ученым года в родном штате Калифорния и в том же 1992 он получил премиею им. Роберта Коха, а год спустя был отмечен Национальной премией Японии и стал Нобелевским лауреатом, навеки вписав свое имя в историю мировой науки.
• Мюллис был трижды женат и имеет троих детей. С 1993 года покинул науку и, купив дом в Калифорнии, осуществил давнюю мечту объявив, что «отныне является писателем».

Личность Керри Мюллиса до сих пор вдохновляет молодых ученых не только на исследования и отстаивание своих идей, но и на отстаивание права жить ярко и неординарно, не соответствуя каноничному образу ученого-химика как схоластичного и строгого книжного червя. В этом, пожалуй, его еще один огромный вклад!