Що таке ПЛР-аналіз: в чому полягає та для чого потрібен ПЛР-тест?

Що таке ПЛР-аналіз: в чому полягає та для чого потрібен ПЛР-тест?

Сучасні лабораторні дослідження вже не можуть існувати без ПЛР: полімеразна ланцюгова реакція давно стала повсякденною і навіть рутинною роботою, але майже сорок років тому викликала справжній фурор в науці, здійснивши революцію в генних дослідженнях.

Що ж такого унікального в ПЛР і яке нині застосування знайшов цей метод? СТАРЛАБ розповідає просто про складне.

 

ПЛР ампліфікація: робимо багато копій!

Для більшості людей, не пов’язаних з лабораторною діагностикою, слово «ПЛР-тест» з’явилося на слуху завдяки пандемії коронавірусу Covid-19 (ПЛР-тест на коронавірус), оскільки ПЛР-тест здатний виявити збудників даного захворювання і рекламується усіма медичними установами. У чому полягає сенс методу і як він працює? Давайте розглянемо на прикладі виявлення вірусу – збудника Covid-19.

В основі методу ПЛР (Полімеразної ланцюгової реакції) лежить вибіркове і багаторазове копіювання (тобто ампліфікація) певного фрагмента ДНК. Процес проводиться в пробірці в лабораторних умовах (in vitro). ДНК для експерименту виділяють з біологічного матеріалу, який традиційно називають «пробою». У ролі проби можуть виступати безпосередньо кров, сеча, волосся, шматочки шкіри, а також різні виділення з організму людини. Загалом – все, що містить клітини з молекулами ДНК. Саме для ковід-тестування беруться проби (мазки) з носа і порожнини рота.

ПЛР дозволяє визначити унікальну послідовність елементів в ДНК і в залежності від мети дослідження дати відповідь на різні питання. У випадку з Ковідом – чи хвора людина, тобто чи присутні в її неповторній і оригінальній ДНК-молекулі фрагменти вірусу.

Збудник Covid-19 – коронавірус SARS-CoV-2 – не містить повноцінної ДНК, а має тільки РНК, тому щоб вижити в людському організмі, йому треба проникнути в клітину і далі вже зробити її «фабрикою», перепрограмувати на відтворення копій самого себе. Тому, щоб виявити вірус у біоматеріалі, треба спочатку перетворити РНК вірусу в ДНК, оскільки ампліфікувати можна виключно ДНК. Цей процес називається «зворотною транскрипцією».

За допомогою хімічних розчинів пробу очищають від білків і жирів, залишаючи тільки чисту РНК, яка, якщо людина хвора на Covid-19, містить не тільки власний генетичний матеріал людини, але і РНК вірусу. Цю очищену пробу транскрибують в ДНК, після чого починається власне ПЛР.

Слід зазначити, що такі додаткові складнощі супроводжують в основному виявлення вірусів. Для інших цілей ПЛР (різні криміналістичні дослідження, встановлення батьківства і т.д.), зворотна транскрипція не потрібна і можна одразу приступати до проведення полімеразної реакції.

 

Як відбувається ПЛР-тест

Особливість ПЛР, яка робить метод вигідним і зручним, полягає в тому, що в ході дослідження копіюються короткі фрагменти ДНК: їх середня довжина – не більше трьох тисяч пар основ. Для порівняння повна довжина геному людини складається з 3 мільярдів пар основ!

Процес полімеразної ланцюгової реакції досить цікавий.

В пробірку, обсяг якої зазвичай коливається від 0,1 до 0,5 мл, кладуть 0,1-0,01 мкг вже готової виділеної геномної ДНК або, якщо такої немає – безпосередньо біоматеріал – сечу, кров, сперму, шматки шкіри, слину, волосся. Побудова нуклеотидного ланцюга, на якому базується метод ПЛР, здійснюється спеціальним ферментом – ДНК-полімеразою (звідси і назва реакції – полімеразна), але для старту ферменту необхідний «поштовх». Дають його, фактично запускаючи стартовий механізм реакції, речовини-«штовхачі», які звуться праймерами. Для ПЛР в ролі праймерів виступають синтетичні олігонуклеотиди довжиною 15-20 нуклеотидів. За технологією, праймерів має бути два і вони обов’язково повинні збігатися з ділянками ДНК-матриці по краях, щоб прилипнути до них і служити маркерами-обмежувачами для ділянки, яка буде багаторазово копіюватися основною «робочою конячкою» реакції – ДНК-полімеразою. Кінці праймерів, які в ході реакції причепляться до кінців фрагмента ДНК, спрямовані всередину нього, тому візуально праймери можна порівняти з ковпачками-обмежувачами. Орієнтуючись на ці «ковпачки» на кінцях фрагмента, ДНК-полімераза «розуміє» з якою обмеженою ділянкою їй треба працювати.

Щоб праймери змогли приєднатися до досліджуваного фрагменту ДНК (матриці) і обрамити його, пробірку із сумішшю спочатку нагрівають до 95°С протягом 1-2 хвилин. Цього часу і температури достатньо, щоб молекула ДНК, що має спіральний вигляд, змінила свою конструкцію в ході процесу денатурації біополімерів (денатурація – зміна структури молекули, що приводить до втрати її природних властивостей). У випадку з молекулою ДНК її спірально закручені нитки розходяться, розділяються і вирівнюються в дві смуги. Після цього починається друга стадія реакції, яка полягає в охолодженні пробірки до температури, що дозволяє праймерам знайти в геномній ДНК компліментарні місця, з якими вони збігаються, і причипитися до них. Для різних праймерів температура другої стадії буде різна, але як правило, вона коливається в районі 60°С. Коли процес причеплення праймерів до фрагменту ДНК завершений і ділянка вже відзначена ними, настає завершальний етап реакції, на якому в справу вступає ДНК-полімераза.

Щоб ДНК-полімераза почала працювати, в пробірці встановлюють температуру 37°С. Стартує синтез нового ланцюга ДНК. ДНК-полімераза повзе по обмеженій праймерами ділянці ДНК-матриці і відтворює з самої себе, як з будівельного матеріалу, точну копію нитки геномної ДНК, яка розплавилася в ході денатурації. Оскільки молекула ДНК двуланцюгова, то спочатку матриць дві. Отже, з однієї молекули виходить дві копії гена. Процес копіювання повторюється, і кожен раз стартова кількість гена ДНК на момент початку реакції буде збільшуватися вдвічі. За 25-35 циклів в пробірці синтезуються мільярди копій фрагмента ДНК, обрамленого праймерами. Такої кількості генного матеріалу достатньо для будь-яких подальших досліджень.

 

ПЛР навколо нас

Полімеразна ланцюгова реакція за майже сорок років існування значно поліпшилася та знайшла широке застосування в науці, криміналістиці, медицині, біології. ПЛР використовують скрізь, де необхідна висока точність результатів і грає роль швидкість процесу діагностики.

Ось лише кілька прикладів, для чого використовують ПЛР-тест в сучасних лабораторіях:

  1. У судово-медичній експертизі метод ПЛР допомагає встановлювати обставини злочинів шляхом аналізу біологічного матеріалу та розкривати складні і заплутані справи.
  2. За допомогою ПЛР можна встановити спорідненість людей, а також батьківство і материнство.
  3. У венерології і інфекційній медицині полімеразна ланцюгова реакція допомагає виявити хламідійні і мікроплазмові інфекції, герпес, сифіліс, туберкульоз, гепатит, ВІЛ та інші захворювання.
  4. ПЛР-дослідження штамів грипу в конкретному ареалі поширення дозволяє розробляти вакцини проти локальних штамів.
  5. У літній період ПЛР-тест допомагає діагностувати захворювання, що передаються кліщами: бореліоз (хвороба Лайма), енцефаліт.
  6. У генній інженерії ПЛР застосовують для клонування генів, щоб створити білки, використовують в сільському господарстві, селекції та інших сферах діяльності.

Проводять реакцію в спеціальних приладах – ампліфікаторах. Зробити тест ПЛР можна тільки в лабораторних умовах.

 

Геніальний винахідник геніального винаходу

Появою методу ПЛР сучасна цивілізація зобов’язана американському біохіміку Керрі Мюллісу (Kary Mullis), який в 1983 році по дорозі з роботи додому придумав, як можна на основі відносно короткого фрагмента ДНК ідентифікувати живі організми.

В основі новаторської ідеї Мюлліса лежить ідея американського вченого Артура Корнберга (Arthur Kornberg), що не знайшла визнання в біохімії того часу. Керрі Мюлліс, фактично зробив своїм відкриттям революцію в науці, став лауреатом Нобелівської премії лише в 1993 році: шлях вченого до визнання був тернистим, йому не раз доводилося відстоювати свої авторські права на метод ПЛР.

Сучасники і колеги Мюлліса відзначають, що біохімік завжди був дуже неординарною і яскравою особистістю, яку важко явити в типовій академічній науковій середі. Ось лише декілька прикладів з життя Мюлліса, які розкривають його дивовижний характер:

  • У дитинстві вчений цікавився польотами і космосом, розробляв, збирав і запускав в небо саморобні ракети, які могли набирати висоту до декількох кілометрів. Одна така ракета з жабою на борту навіть налякала пілотів пасажирського літака. Інтерес до хімії у Мюлліса почався з експериментів з вибуховими речовинами, які також регулярно лякали сусідів.
  • Багато вчених вважають Мюлліса ексцентриком, так як він тривалий час публічно виступав за легалізацію легких наркотиків і стверджував, що американці не були на Місяці, а всесвітньо відомі кадри висадки зняли в павільйонах Голлівуду.
  • Бувши за фахом біохіміком і все життя працюючи в цій сфері, Керрі Мюлліс мріяв про кар’єру письменника, публіциста і поета. Довгі роки він «писав у шухляду» вірші і прозу, а також невеликі публіцистичні огляди. Мюлліс відгукувався про свій літературний талант з іронією, проте його нобелівська промова, жива, яскрава і динамічна, має художню цінність і до сьогодні є однією з кращих за всю історію премії.
  • Доля методу ПЛР-ампліфікації, теж не була простою. Як розповів сам вчений, редакції найпрестижніших наукових журналів Science і Nature відхилили статтю Мюлліса про ПЛР-метод, заявивши, що публікують тільки статті, що мають загальнонаукове значення, ПЛР-ампліфікація може бути цікавою лише вузьким фахівцям.
  • У 1990 році Мюлліс все-таки отримав визнання і був нагороджений престижною німецькою премією Preis Biochemishe Analytik, два роки по тому його назвали вченим року в рідному штаті Каліфорнія і в тому ж 1992 він отримав премію ім. Роберта Коха, а рік по тому був відзначений Національною премією Японії і став Нобелівським лауреатом, навіки вписавши своє ім’я в історію світової науки.
  • Мюлліс був тричі одружений і має трьох дітей. З 1993 року покинув науку і, купивши будинок в Каліфорнії, здійснив давню мрію оголосивши, що «відтепер є письменником».

Особистість Керрі Мюлліса досі надихає молодих вчених не тільки на дослідження і відстоювання своїх ідей, але і на відстоювання права жити яскраво та неординарно, не відповідаючи канонічності образу вченого-біохіміка як схоластичного і суворого книжкового хробака. У цьому, мабуть, його ще один величезний внесок!